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jenabioscience PP-101說明書

更新時(shí)間:2019-10-25      點(diǎn)擊次數(shù):2257

 

Jena Bioscience由德國馬普所(MPI)的分子生理學(xué)家于1998年共同創(chuàng)辦的生物公司,致力為的科研院所、醫(yī)院、制藥企業(yè)以及診斷試劑盒生產(chǎn)企業(yè)提供各類試劑。在結(jié)構(gòu)學(xué)研究方面全面提供晶體篩選試劑盒、優(yōu)化試劑、工具和各類耗材等。

jenabioscience PP-101說明書

JBS dNTP-Mutagenesis Kit

JBS dNTP誘變試劑盒

dNTP類似物的隨機(jī)誘變

 

貨號規(guī)格價(jià)格(歐元)購買/注意
PP-10115反應(yīng)260,16添加到購物籃/報(bào)價(jià)添加到記事本

圖1:dPTP和8-Oxo-dGTP的結(jié)構(gòu)
圖1:dPTP和8-Oxo-dGTP的結(jié)構(gòu)

圖2誘變率與PCR循環(huán)數(shù)的關(guān)系[Zaccolo等]
圖2:誘變速率與PCR循環(huán)數(shù)的關(guān)系[Zaccolo 等。]

僅用于體外

運(yùn)輸:在藍(lán)色冰上運(yùn)輸

儲存條件:在-20°C下儲存,
避免冷凍/融化循環(huán),強(qiáng)烈建議在使用前等分修飾核苷酸

保質(zhì)期: 12個(gè)月

描述:
JBS誘變系列
在三十億年的進(jìn)化過程中,自然界通過反復(fù)反復(fù)的隨機(jī)誘變循環(huán),然后通過體內(nèi)選擇編碼蛋白的功能,自然產(chǎn)生了過多的蛋白。在過去的二十年中,這個(gè)自然進(jìn)化的例子指導(dǎo)研究人員開發(fā)了蛋白質(zhì)體外排列的策略。
在應(yīng)用的各種策略中,出現(xiàn)了三種主要的強(qiáng)大技術(shù)。

dNTP類似物的隨機(jī)誘變
此方法基于通過PCR將誘變的dNTP類似物(例如8-oxo-dGTP和dPTP)摻入擴(kuò)增的DNA片段中。僅在四種天然dNTP的存在下,通過第二個(gè)PCR步驟消除了誘變dNTP,致突變率高達(dá)20%。
→ JBS dNTP誘變試劑盒#PP-101


由Caldwell&Joyce(1992)開發(fā)的Error-Prone PCR進(jìn)行隨機(jī)誘變該方法在引起DNA聚合酶錯(cuò)誤率增加的條件下,利用PCR反應(yīng)在目的基因中引入了突變。易錯(cuò)PCR的誘變率在0.6-2.0%的范圍內(nèi)。
→ JBS Error-Prone套件#PP-102

通過DNA
改組進(jìn)行隨機(jī)誘變 Stemmer(1994)開發(fā)的DNA改組通過隨機(jī)分裂一個(gè)基因或一組相關(guān)基因來生成文庫,然后在自引發(fā)PCR反應(yīng)中重組片段。該方法允許重組來自不同相關(guān)基因的序列。誘變的總速率約為。0.7%。
→ JBS DNA改組試劑盒#PP-103

Jena Bioscience現(xiàn)在在單獨(dú)的套件中提供了每種“即用型”技術(shù)所需的所有必要組件,并附有精簡的文檔,可很大程度地提高成功率。

含量:
Taq聚合酶(紅色帽)
5單位/微升,40微升

誘變緩沖液(綠帽)
10x濃度,200μl

dNTP混合液(白色帽)
每個(gè)10 mM dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dTTP),100μl

dPTP(黃色瓶蓋)
10 mM,40μl

8-oxo-dGTP(藍(lán)帽)
10 mM,40μl

PCR級水(白色瓶蓋)
2x 1毫升

dNTP類似物
8-oxo-dGTP和dPTP的隨機(jī)誘變是誘變的dNTP類似物,可使用Taq聚合酶通過PCR將其摻入DNA [Zaccolo 等。,Zang 等。]。
將8-Oxo-dGTP摻入模板腺嘌呤對面,產(chǎn)生兩個(gè)過渡突變:A→C:T→G。誘變的總速率約為 據(jù)報(bào)道有2%(圖2),其中A→C:T→G的比率約為1。1:1.5。

據(jù)報(bào)道,dNTP模擬物dPTP約為。誘變作用是8-oxo-dGTP的10倍(圖2)。dPTP誘導(dǎo)的突變以大約5:4:1:1的比率發(fā)生(A→G:T→C:G→A:C→T),總誘變率高達(dá)19%。
由8-Oxo-dGTP和/或dPTP誘導(dǎo)的隨機(jī)誘變在兩步PCR過程中進(jìn)行。首先,在四種天然dNTP加誘變類似物dPTP和/或8-Oxo-dGTP的存在下擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段。誘變速率可以通過PCR循環(huán)數(shù)輕松控制(圖2)。

然后,在不存在誘變類似物的情況下,將首輪PCR的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR。該步驟在克隆和轉(zhuǎn)化之前從靶DNA中消除了非天然類似物。

推薦的測定準(zhǔn)備

  • 對于50μl反應(yīng),請?jiān)跓o菌小瓶中加入5μl10x誘變緩沖液
  • 添加多25 fmol模板DNA和0.2-1μM合適的引物
  • 加入2.5μldNTP混合物
  • 加入2.5μl每個(gè)誘變類似物
  • 加入1μl(5 u)Taq聚合酶
  • 加入PCR級水至終體積為50μl

推薦的熱循環(huán)條件

變性92°攝氏度1分鐘
退火55°攝氏度1.5分
延期72°攝氏度5分鐘


循環(huán)數(shù):5-30(請參見圖2)
。誘變的速率主要取決于循環(huán)數(shù)(圖2),并且可以通過誘變dNTP的數(shù)量進(jìn)行微調(diào)[Zaccolo 等。]。

 

終PCR
為了消除誘變性dNTP,在第二步PCR中使用等分的1μlPCR反應(yīng)作為模板。取10x誘變緩沖液,并按上述相同濃度添加模板,引物,dNTP Mix和Taq聚合酶。裝滿PCR級水至50μl。
使用相同的熱循環(huán)條件,但20-30個(gè)循環(huán)。

精選參考文獻(xiàn):
Zang 等。(2006)而高保真度的dCTP與7,8-dihydro-8-oxodeoxyguanosine相對,通過sololotarius DNA聚合酶Dpo4。Journal of Biological Chemistry281:2358。
Zaccolo 等。(1999)高頻隨機(jī)誘變對體外蛋白質(zhì)進(jìn)化的影響:TEM-1β-內(nèi)酰胺酶的研究。J.摩爾 生物學(xué) 285(2):775。
Crameri 等。(1998)DNA改組從不同種類的基因家庭加速定向進(jìn)化。自然 391:288。
Zaccolo 等。(1996)一種使用核苷類似物的三磷酸酯衍生物的混合物隨機(jī)誘變DNA的方法。J.摩爾 生物學(xué) 255:589。
Stemmer(1994)通過DNA改組在體外快速進(jìn)化蛋白質(zhì)。自然 370:389。
Cadwell 等。(1992)通過PCR誘變使基因隨機(jī)化。PCR方法。應(yīng)用 2:28。

 

 

 

 

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